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熒光定量PCR儀的數(shù)據(jù)分析從哪些方面入手
點(diǎn)擊次數(shù):758 更新時(shí)間:2022-10-27
    熒光定量PCR儀,由熒光定量系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)組成,用來(lái)監(jiān)測(cè)循環(huán)過(guò)程的熒光。與實(shí)時(shí)設(shè)備相連的計(jì)算機(jī)收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過(guò)開(kāi)發(fā)的實(shí)時(shí)分析軟件以圖表的形式顯示。原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強(qiáng)度相對(duì)于循環(huán)數(shù)的圖表。原始數(shù)據(jù)收集后可以開(kāi)始分析。實(shí)時(shí)設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行正?;幚韥?lái)彌補(bǔ)背景熒光的差異。正?;罂梢栽O(shè)定域值水平,這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。
  在qPCR進(jìn)程中,隨著產(chǎn)物的積累,熒光信號(hào)的強(qiáng)度等比加強(qiáng)。每經(jīng)過(guò)一次循環(huán),收集一次熒光信號(hào),即可得到一個(gè)熒光擴(kuò)增曲線,根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化即可監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化。熒光擴(kuò)增曲線可分為三個(gè)階段,即熒光背景信號(hào)階段、熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段,PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,因此可以在該階段進(jìn)行定量分析。為了便于對(duì)所檢測(cè)樣本進(jìn)行比較,在指數(shù)期需要設(shè)定一個(gè)熒光信號(hào)的閾值。檢測(cè)到的熒光信號(hào)超過(guò)閾值則被認(rèn)為是真正的信號(hào)。熒光信號(hào)由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的閾值所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)稱為Ct值。模板的Ct值與其起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,則Ct值越小利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品及其相應(yīng)的Ct值可繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)得未知樣品的Ct值后,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線便可準(zhǔn)確計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
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