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熒光定量PCR儀使用時(shí)要注意以下幾點(diǎn)操作
點(diǎn)擊次數(shù):726 更新時(shí)間:2022-10-19
     熒光定量PCR儀將熒光基團(tuán)加入到PCR反應(yīng)體系中,通過不斷累積熒光信號從而使對PCR全程的實(shí)時(shí)監(jiān)測實(shí)現(xiàn),再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析未知模板的方法,即是熒光定量PCR技術(shù)。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中,實(shí)時(shí)檢測全程PCR擴(kuò)增過程,按照反應(yīng)時(shí)間和熒光信號的變化能夠?qū)⒁粭l曲線繪制成。
  混合模板DNA和有熒光素的Taqman探針,遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律使高溫變性,低溫復(fù)性,適溫延伸的熱循環(huán)完成,切斷和模板DNA互補(bǔ)配對的Taqman探針,熒光素在反應(yīng)體系中游離。熒光在特定光激發(fā)下發(fā)出,被擴(kuò)增的目的基因片段隨著循環(huán)次數(shù)的增加呈指數(shù)級增長,Ct值根據(jù)實(shí)時(shí)檢測與之對應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號強(qiáng)度求取出來,同時(shí)對照多個(gè)已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,就能夠使待測標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)得出。
  熒光定量PCR儀需要規(guī)范樣品核酸提取和實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增時(shí)的操作,避免樣品交叉污染,酶被降解,出現(xiàn)假陽性的情況。
 ?。?)根據(jù)試驗(yàn)的分區(qū)嚴(yán)格操作,按照提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、檢測區(qū)單方向流動(dòng),不能夠逆向流動(dòng)物品、樣品和試劑。
 ?。?)在對多份樣品進(jìn)行操作的時(shí)候,制備反應(yīng)混合液,首先混合好熒光PCR反應(yīng)液、熒光探針和酶。之后在每個(gè)PCR管中進(jìn)行分裝,如此不僅會(huì)使操作次數(shù)減少,而且能夠使污染避免,還能夠使反應(yīng)的精確度增加。
 ?。?)在對樣品和蛋白酶k添加的過程中,要對避免酶的降解和樣品的交叉污染尤其留心。
  (4)在操作的時(shí)候,需要將陰性及陽性對照設(shè)立,能夠?qū)晒釶CR反應(yīng)的準(zhǔn)確性和可信性進(jìn)行驗(yàn)證。
 ?。?)使用的離心管、槍頭和PCR管需要確保沒有污染,或者將它們進(jìn)行高壓滅菌。
 ?。?)在完成核酸的提取之后應(yīng)當(dāng)立刻進(jìn)行儀器的擴(kuò)增,不能夠在室溫環(huán)境下過長時(shí)間放置提取的核酸,空氣中的酶能夠輕易的將其降解,其可以在-70℃冰箱內(nèi)長期保存,在-20℃冰箱內(nèi)短期保存。
 ?。?)因?yàn)楫a(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA會(huì)很容易對移液器造成污染,所以需要使用可高壓處理的移液器。
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